수트렙토마이신 (SM) ELISA 장비 대회 시험
1. 원리
이 시험 장비는 술폰아미드 잔류물의 탐지를 위한 경쟁적인 효소 면역화학적검정에 근거를 둡니다. 연결 항원은 마이크로 잘 줄무늬에 전 입힙니다. 마이크로 잘 줄무늬에 반대로 술폰아미드 항체에 대해 전 입히는 표본 및 연결 항원에 있는 술폰아미드는 경쟁합니다. 효소 어원이 같은 말의 추가가 채색을 위해, TMB 기질 추가된 후에. 표본의 광학 조밀도 (OD) 가치에는 표본에 있는 술폰아미드도의 부정 상호 관계가 있습니다. 이 가치는 표준 곡선과 비교되고 술폰아미드 농도는 연속적으로 얻어집니다.
2. 기술 명세
감도: 1개의 ppb
부화기 온도: 25℃
부화기 시간: 30min~15min
탐지 한계
조직 (높 탐지 한계 방법) 0.4 ppb
조직 (낮 탐지 한계 방법) 5 ppb
Honey1 ppb
감도: 0.1 ppb
외피 온도: 37℃
외피 시간: 30min-30min-15min
탐지 한계:
닭 1 ppb
닭 간은, 4 ppb를 젖을 짭니다
꿀, 왕 묵 2 ppb
회복율:
우유 85±22%
닭 80±17%
꿀, 왕 묵 75±19%
교차 반응 비율:
수트렙토마이신 100%년
다이하이드로 스트렙토마이신 108%년
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교차 반응 <0>
비율에서 내려지는 Kalamycin Gentamycin 결론: 이 장비는 술폰아미드의 시험을 위해, 완전히 응합니다 술폰아미드의 국가 테스트 요구에 이용될 수 있습니다.
회복율
조직, 소변, milk85±25%
꿀, serum80±23%
3. 성분
1) 마이크로 잘 지구: 8개의 이동할 수 있는 우물을 가진 12의 지구 각각
2) 6× 표준 솔루션 (제각기 1개 mL): 0개의 ppb, 0.1 ppb, 0.4 ppb, 1.6 ppb, 6.4 ppb, 25.6 ppb
3) 효소 결합되는 (12 mL) 빨간 모자
4) 항체 일 해결책 (7개 mL) 파란 모자
5) 기질 A 해결책 (7개 mL) 백색 모자
6) 기질 B 해결책 (7개 mL) 검정 모자
7)는 해결책 (7개 mL) 황색 모자를 멈춥니다
8) 20×는 세척 완충기 (40 mL) 백색 모자에 집중했습니다
9) 10×는 해결책 (50 mL) 투명한 모자를 redissolving 집중했습니다
4. 요구되고는 그러나 제공되지 않는 물자
1) 장비: microplate 독자, 인쇄공, 균질화기, 질소 건조 장치, 측정하는 분리기는, 균형 (0.01 g) 의 부화기의 상호 감각력 피펫으로 옮깁니다
2) Micropipettes: 단 하나 수로 20-200 µL, 100-1000 µL 및 다중채널 30-300 µL;
3) 시약: 아세토니트릴 (CH3CN), 에틸 아세테이트, N 제초제, K2HPO4·12H2O의 구연산 monohydrate (C6H8O7·H2O), HCl, NaOH, CH2Cl2,
5. 표본 전처리
지시 (뒤에 오는 점은 전처리의 앞에를 취급되어야 합니다)
1) 단지 처분할 수 있는 끝은 실험을 위해 사용될 수 있고 다른 시약 흡수를 위해 사용될 때 끝은 바뀌어야 합니다;
2) 실험의 앞에, 각 실험적인 기구는 청결해야 하고, 실험적인 결과와 방해하는 오염을 피하기 위하여 필요하다면 재 청소되어야 합니다.
표본 전처리의 앞에 해결책 준비:
1) 0.2M NaOH 해결책: 0.8g NaOH의 무게를 다십시오, 100ml에 의하여 이온을 제거된 물로 녹이십시오;
2) 0.5M HCl: 4.3ml HCl를 가지고 가고십시오, 이온을 제거한 물, 혼합으로 100ml에 균등하게 녹이십시오;
3) Na2HPO4- C6H8O7·H2O 완충기: 19.85gNa2HPO4의 무게를 다십시오·12H2O와 9.3g C6H8O7·H2O는 1L에 이온을 제거한 물, 혼합으로, 균등하게 녹입니다;
4) CH3CN-CH2Cl2 해결책: V CH3CN: V CH2Cl2 =1:4;
5) 20×에 의하여 집중된 재 녹이는 해결책은 1:19 (1개 부품에 의하여 집중되는 재 녹이는 해결책 + 이온을 제거된 물 19 부품)에 이온을 제거한 물로 묽게 됩니다.
5.1 조직
A. 높 탐지 한계 방법
방법 하나
1)는 50 ml 분리기 관으로 균질화한 조직 추출의 2.0 ± 0.05 g를, 추가합니다 에틸 아세테이트 6개 ml, 2 분, 10 분 동안 15 ℃에 4000 r/min의 위에 분리기를 위한 동요 잽니다;
2)는 건조한 콘테이너로 3개 ml에게 명확한 유기 단계가 걸리고, 50-60 ℃에 회전하는 증발에 의하여 질소 또는 공기로 완전하게 말리기 위하여 붑니다
6)는 묽게 된 재 녹이는 해결책의 1개 mL에 있는 건조한 잔류물을, 추가합니다 N 제초제 1개 mL, 30 초 동안 혼합 녹입니다; 5 min. 동안 15℃에 4000 r/min의 위에 분리기는 상위층 N 제초제 단계를 제거합니다,
7) 추가 분석을 위한 포획 아래로 층 50µl 해결책.
표본의 희석의 겹: 1
방법 2
1)는 50ml 원심 분리기 관으로 균질화한 표본의 2 ± 0.05 g를, 끼워넣었습니다 잽니다;
2)는 8ml CH3CN-CH2Cl2 해결책, 5min를 위한 동요, 10 분 동안 15 ℃에 4000 r/min의 위에 분리기를 추가합니다;
3)는 건조한 콘테이너로 4개 ml 유기 단계를 옮기고, 56 ℃에 회전하는 증발에 의하여 질소 또는 공기로 완전하게 말리기 위하여 붑니다
4)는 묽게 된 재 녹이는 해결책의 1개 건조한 잔류물을 재 녹이기 위하여 mL를 추가하고, N 제초제 1개 mL 추가하고, 30s를 위해 동요합니다. 5 분 동안 15℃에 4000 r/min의 위에 분리기;
5)는 상위층 N 제초제 단계를 제거합니다. µL가 아래로 추가 분석을 위한 해결책을 층을 이루는 50를 가지고 가십시오.
표본의 희석의 겹: 1
B. Tissue 낮 탐지 한계 방법
1)는 50 ml 원심 관으로 균질화한 표본의 2.0 ± 0.05 g를, 추가합니다 8개 mL에 의하여 묽게 된 재 녹이는 해결책, 2 분, 10 분 동안 15 ℃에 4000 r/min의 위에 분리기를 위한 동요를 잽니다;
2)는 추가 분석을 위한 50의 µL 해결책을 가지고 갑니다.
표본의 희석의 겹: 5
5.2 혈청
1)는 10 분 동안 10 ℃에 혈청의 4000r/min의 위에 30 분, 분리기, 별거 또는 여과기 혈청을 위한 실내 온도에 있는 혈청 표본을 둡니다
2)는 1개 mL 혈청을 가지고 가고 3mL를 묽게 된 재 녹이는 해결책, 30s를 위한 혼합 추가합니다.
3)는 추가 분석을 위한 50의 µL 해결책을 가지고 갑니다
표본의 희석의 겹: 4
5.3 꿀
1. 2±0.05 g 꿀 표본의, 추가합니다 0.1 M H3PO4의 완전히 녹이는까지 동요의 4개 mL를 무게를 다십시오.
2. 액체가 명확할 때까지, 5 분 동안 실내 온도 (20-25 ℃)에 4000 r/min의 위에 원심 작용을 받게 하십시오 (꿀 표본은 분리기 없이 단계 3에 직접 할 수 있습니다).
3. 900 µL를 1개 M NaOH, 맞춥니다 7-9에 PH를 추가하십시오 (왕 묵을 위해, 새로운 배로 상청액을 옮기십시오).
4. 액체가 명확할 때까지, 5 분 동안 실내 온도 (20-25 ℃)에 4000 r/min의 위에 원심 작용을 받게 하십시오.
5. 50의 µL 상청액을 가지고 가고, 묽게 된 재 녹이는 해결책의 350 µL를 추가하고, 30s를 위해 균등하게 섞으십시오.
6. 50에게 추가 분석을 위한 µL를 가지고 가십시오.
표본의 희석의 겹: 20
5.4 소변
1. 3개 mL 묽게 된 재 녹이는 해결책 및 원심 작용을 받게 한 명확한 소변 샘플의 1개 mL, 혼합을 30s를 위해 제대로 추가하십시오.
2. 50에게 추가 분석을 위한 µL를 가지고 가십시오
표본의 희석의 겹: 4
5.5 우유
1. 우유 1개 mL, 추가합니다 1:19 (Ⅴ/Ⅴ) (20의 µL 우유 + 380 µL 묽게 된 재 녹이는 해결책), 그리고 30s를 위한 혼합에 묽게 한 묽게 된 재 녹이는 해결책을 가지고 가십시오.
2. 50에게 추가 분석을 위한 µL를 가지고 가십시오
표본의 희석의 겹: 20
6. ELISA 절차
6.1 지시
1. 사용의 앞에 실내 온도에 (20-25 ℃) 모든 시약 및 마이크로 잘 지구를 가져오십시오;
2. 사용의 직후 2-8 ℃에 모든 시약을 돌려보내십시오;
3. ELISA 분석의 재현성은, 고도로, 판 씻기의 견실함에 달려 있습니다. 판 씻기의 정확한 가동은 ELISA의 절차에 있는 요점입니다;
4. 항온에 외피를 위해, 모든 표본 및 시약은 가벼운 노출을 피해야 하고, 각 microplate는 덮개 막에 의해 밀봉되어야 합니다.
6.2 가동 절차
1. 모든 필요한 시약을 밖으로 가지고 가고 적어도 30min를 위한 실내 온도 (20-25 ℃)에 두십시오. 각 시약이 사용의 앞에 균등하게 섞기 위하여 동요되어야 한다는 것을 유의하십시오;
2. 필수 마이크로 잘 지구 및 판 구조를 가지고 가십시오. 2 - 8 ℃에 저장된 사용되지 않는 microplate를 다시 봉했습니다;
3. 세척 완충기 준비: 1:19 (1개 부품 20×에 의하여 집중되는 세척 완충기 + 이온을 제거된 물 19 부품)에 이온을 제거한 물로 20×에 의하여 집중된 세척 완충기의 40 mL를 묽게 하십시오. 또는 필요로 한 양으로 세척 완충기를 준비하십시오.
4. 열거: 표본과 표준 솔루션에 따라 마이크로 우물을 열거하십시오; 각 표본 및 표준 솔루션은 이중으로 실행되어야 합니다; 그들의 위치를 기록하십시오;
5. 표본의 50 µL를 추가하거든 이중 우물을 분리하는 표준 솔루션은, 효소 어원이 같은 말의 50 µL를 추가하고, 그 후에 각각으로 항체 일 해결책의 50 µL를 잘 추가합니다. 온화하게 동요해서 섞고, 덮개 막을 가진 microplate를 밀봉하고, 30 분 동안 25℃에 알을 품으십시오;
6. 4 5 시간 동안 250 µL/well에 세척 완충기를 가진 microplate를 세척하십시오.; 흡수성 종이로 말리기 위하여 15-30 SEC 동안 세척 완충기, 플랩으로 잘 적시십시오 (펄럭이기 후에 거품이 있고 자르는 경우에, 청결한 끝에 그(것)들을);
7. 채색: 각각으로 B 해결책의 기질 A 해결책의 50 µL를 및 50 µL 잘 추가하십시오. 온화하게 동요해서 섞고, 채색을 위한 암흑에 있는 15 분 동안 25 ℃에 알을 품으십시오;
8. 결심: µL가의 각각으로 해결책을 잘 멈추는 50를 추가하십시오. 온화하게 동요해서 섞으십시오. OD 가치를 결정하기 위하여 450 nm에 microplate 독자의 파장을 놓으십시오. (450/630 nm 이중 파장에 OD 가치를 5 분 안에 읽는 것을 추천하십시오).
7. 결과 판단
결과를 재판하는 2개의 방법이 있습니다; 처음 것은 두번째 양이 많은 결심인 그러나, 거친 판단입니다. 표본의 OD 가치에는 표본에 있는 술폰아미드의 내용과의 부정 상호 관계가 있다는 것을 유의하십시오.
7.1 품질 결심
농도 범위 (ng/mL)는 비교에서 표준 솔루션의 그것을 가진 표본의 평균 OD 가치를 얻었습니다. , 표본 Ⅱ의 그것은 1.0이고, 표준 솔루션의 OD 가치를 표본 Ⅰ의 OD 가치가 0.3이다 추정하는 것은: 0ppb를 위해 2.243는, 1ppb를 위해 1.816, 3ppb를 위해 1.415, 9ppb를 위해 0.74, 27ppb를 위해 0.313, 81ppb를 위해 0.155, 그러므로 표본 Ⅰ의 농도 범위 27ppb에 81ppb이고, 표본 Ⅱ의 그것은 3ppb에 9ppb입니다. (대응 희석 겹에 의해 곱해)
7.2 양이 많은 결심
흡수도 가치의 평균값은 첫번째 표준 솔루션 (0개의 기준)의 OD 가치 (B0)에 의해 분할되고 연속적으로 100%년까지, i.e 곱한, 표본 및 표준 솔루션의 평균 OD 가치 (b)의 백분율과 동등합니다
흡수도 가치 = B ×100% /B0의 백분율
B-the는 (두 배 우물) 표본 표준 솔루션의 OD 가치를 평균합니다
B0-the는 0ng/mL 표준 솔루션의 OD 가치를 평균합니다
Y-와 x-축으로 표준 솔루션의 흡수 백분율 및 술폰아미드 표준 솔루션 (ng/mL)의 대수 가치를 가진 표준 곡선을, 각각 반 당기십시오. 표준 곡선으로 그것의 흡수 백분율을 통합해서 표준 곡선에서 표본의 대응 농도를 해석하십시오. 유래 가치는 마지막으로 표본에 있는 술폰아미드 농도를 얻는 대응 희석 겹에 의해 연속적으로, 곱합니다.
직업적인 분석을 사용하여 이 장비의 소프트웨어는 다량의 표본의 정확하고 급속한 분석을 위해 더 편리할 것입니다. (이 소프트웨어를 위해 저희에게 연락하십시오).
8. 경고
1. 25 ℃ 이하 실내 온도 또는 실내 온도에 (20-25 ℃) 돌려보내지지 않는 더 낮은 기준 OD 가치로 시약 및 표본의 온도는 이끌어 낼 것입니다.
2. 씻기 과정에 있는 microplate의 건고는 비선형 표준 곡선 및 바람직하지 않는 재현성을 포함하여 상황을 동반될 것입니다; 따라서 세척의 직후 다음 단계에 계속하십시오.
3. 균등하게 섞으십시오, 그렇지 않으면 바람직하지 않는 재현성이 있을 것입니다.
4. 정지 해결책은 2개 M 황산 해결책, 피부도 접촉하는 것을 피합니다입니다.
5. 그것의 만기일을 초과하는 장비를 이용하지 마십시오. 장비에서 묽게 했거나 썩음질을 한 시약의 사용은 감도 및 검출 OD 가치에 있는 변화로 이끌어 낼 것입니다. 사용하기 위하여 다른 추첨 번호의 장비에서 시약을 교환하지 마십시오.
6. 그것을 다시 봉하기 위하여 자동 바다표범 어업 부대로 사용되지 않는 microplate를 끼워넣으십시오. 이전 표준 물질 및 무색 색깔은 가볍습니다 - 과민한 및 이렇게 직접 빛에 드러낼 수 없습니다.
7. 이 해결책의 퇴보를 나타내는 어떤 색깔든지를 가진 채색 해결책을 버리십시오. 0개의 표준 솔루션의 검출 가치의 0.5 이하 (A450 nm< 0="">
8. 최적 반응 온도는 25 ℃이고, 너무 높이 또는 너무 저온은 검출 감도 및 OD 가치에 있는 변화 귀착될 것입니다.
9. 저장과 만기일
저장: 얼지 않는 2-8 ℃에 상점.
만기일: 1 년; 생산의 날짜는 상자에 있습니다.
